在生物樣本庫和細(xì)胞治療行業(yè)中，基于氣相液氮（LN2）的存儲(chǔ)系統(tǒng)儲(chǔ)存樣本十分常見,。這類液氮罐能夠提供低于-150℃的儲(chǔ)存環(huán)境,，從而將樣本保持在-135℃以下,，即水的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（Tg）。這種低溫儲(chǔ)存方法保持了樣本的活性,。
在常規(guī)凍存架暴露過程中,，無關(guān)樣本（不需要解凍的樣本）可能會(huì)受到影響。數(shù)以千計(jì)的無關(guān)樣本在整個(gè)儲(chǔ)存期間可能會(huì)多次暴露,，在玻璃化轉(zhuǎn)變階段持續(xù)解凍/冷凍可能會(huì)造成不可逆的損壞,，并在解凍時(shí)影響樣本功能。
本篇文章我們通過手動(dòng)和自動(dòng)系統(tǒng)處理無關(guān)樣本所展現(xiàn)的工作流程,、時(shí)間和升溫速率作出了方案對(duì)比,。使用手動(dòng)LN2液氮罐過程中，通過從液氮罐取出（拉出）凍存架對(duì)標(biāo)準(zhǔn)凍存架中五個(gè)不同擱板位置的樣本（水）進(jìn)行監(jiān)控,。以及使用AI智能生命數(shù)據(jù)庫M9,，使用相同設(shè)置和位置重復(fù)該實(shí)驗(yàn)。
生物樣本手動(dòng)存儲(chǔ)
生物樣本自動(dòng)化存儲(chǔ)
|材料
1,、AI智能生命數(shù)據(jù)庫M9,；
2、LN2-196℃蒸汽液氮罐（ARD）,，帶凍存架,；
3、5個(gè)10 x10帶蓋凍存盒,；
4,、5個(gè) 2mL凍存管，放置在每個(gè)凍存盒的中心位置,；
5,、所有凍存管裝滿2mL水；
6,、36 AWG T型熱電偶安裝在水位中間,；
7、測(cè)量計(jì)算TC-Temp數(shù)據(jù)采集設(shè)備,，使用TracerDAQ軟件以1.0hz,。
|方法
1、2mL凍存管裝滿2mL水并安裝細(xì)線熱電偶,；
2,、將凍存管放入凍存盒中心位置,，蓋上蓋子，然后將凍存盒分別插入凍存架的擱板1（頂層）,、擱板4,、擱板7、擱板10和擱板13中,；
3,、監(jiān)控凍存管，直到頂部?jī)龃婧袃?nèi)樣本溫度達(dá)到-180℃±2℃,；
4,、使用AI智能生命數(shù)據(jù)庫M9取出凍存架10次；
5,、手動(dòng)取出凍存架并移到液氮罐一側(cè)10次,；
6、使用AI智能生命數(shù)據(jù)庫M9取出凍存架并分別放至擱板1,、3,、5、7和14上5次,；
7,、不移除、處理或觸摸凍存盒,。
|結(jié)果
|與常規(guī)工作流程的對(duì)比
手動(dòng)LN2液氮罐中取出樣本的工作流程可能因?qū)嶒?yàn)室,、用戶甚至日常情況而異。由于整個(gè)過程手動(dòng)完成,，因此不會(huì)自動(dòng)監(jiān)控和記錄無關(guān)樣本暴露,、取出時(shí)間和庫存。
手動(dòng)LN2液氮罐中取出凍存盒的標(biāo)準(zhǔn)步驟：
1. 走上腳梯
2. 取下蓋子
3. 向內(nèi)伸手轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)盤,，找到所需的凍存架
4. 將凍存架向上提起并取出
5. 把凍存架放在液氮罐上,，或者走下來放在工作臺(tái)上或底板上
6. 打開凍存架固定卡扣
7. 找到并移除所需的凍存盒
8. 鎖定凍存架固定卡扣
9. 將凍存架提起，然后放回液氮罐
10. 蓋上蓋子
11. 走下腳梯
從AI智能生命數(shù)據(jù)庫M9中取出凍存盒的標(biāo)準(zhǔn)步驟：
1. 將樣本編號(hào)或位置輸入電腦并提交
2. 出現(xiàn)提示（凍存架升高）時(shí),，打開門并移動(dòng)凍存盒
3. 凍存架會(huì)自動(dòng)收回到液氮罐
|用時(shí)對(duì)比
使用手動(dòng)液氮罐,，每個(gè)凍存盒的取出可能需要不同的時(shí)間，這取決于其在液氮罐中的位置以及操作者的速度和準(zhǔn)確性,。以下是估計(jì)時(shí)間：
? 2分鐘：找到并取出凍存盒的時(shí)間
? 30秒到2分鐘：凍存架暴露在LN2液氮罐外的時(shí)間
使用AI智能生命數(shù)據(jù)庫M9取回凍存盒,，工作流程標(biāo)準(zhǔn)化并通過自動(dòng)化進(jìn)行控制,。用時(shí)會(huì)因箱子的位置而異,，但凍存架的暴露是可控的。
? 30到90秒：找到并取出液氮罐的時(shí)間
? 15到30秒：凍存架暴露在LN2液氮罐外的時(shí)間
隨著自動(dòng)化的使用,，人工勞動(dòng)大大減少,。此外,，所有行動(dòng)和樣本暴露都受到控制、監(jiān)測(cè)和記錄,。
|樣本升溫速率
在手動(dòng)工作流程中,，凍存架在液氮罐外的時(shí)間一般超過30秒。使用自動(dòng)化流程,，可以減少凍存架的暴露時(shí)間,，并且在凍存架周圍增加隔熱層，也可以減少樣本的升溫,。但為了進(jìn)行同等比較,，下圖顯示了手動(dòng)和自動(dòng)凍存架拉出過程中，每個(gè)無關(guān)樣本在環(huán)境暴露的前30秒升溫速率,。
對(duì)比平均所有擱板的樣本升溫速率,，M9在暴露的前30秒升溫速率比手動(dòng)流程慢70%。擱板1中的升溫速率最高,，盡管M9對(duì)于較低擱板具有相對(duì)線性的升溫速率,，但手動(dòng)凍存架在不同擱板之間具有顯著的差異。
注：手動(dòng)凍存架升溫會(huì)受到環(huán)境的進(jìn)一步影響,。擱板13（可能還有擱板14）受到凍存架所在表面的影響,，我們發(fā)現(xiàn)隔熱泡沫提供了最低的熱傳遞。標(biāo)準(zhǔn)空調(diào)通風(fēng)口的室內(nèi)氣流也會(huì)影響手動(dòng)凍存架升溫約30%,。
|隔板位置
下面顯示了每個(gè)擱板從取出到-120℃（超過玻璃化轉(zhuǎn)變溫度）的升溫速率以及達(dá)到-120℃的平均時(shí)間,。
如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水,，以防止細(xì)胞內(nèi)形成大冰晶,；相反，結(jié)晶就大,，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜,、細(xì)胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融,，目的是防止小冰晶形成大冰晶,，即冰晶的重結(jié)晶。
|樣本溫度
以下是使用手動(dòng)和M9工作流程暴露2分鐘期間所有5個(gè)無關(guān)樣本的溫度,。
下圖顯示了使用M9系統(tǒng)從擱板1（頂部）和擱板7取回凍存盒時(shí)所有5個(gè)無關(guān)樣本的溫度,。請(qǐng)注意，與從LN2液氮罐中取出整個(gè)凍存架相比,，下層擱板樣本的溫度要低得多,。為保護(hù)無關(guān)樣本升溫，最好僅將凍存架提升至取出所需凍存盒所需的最小高度,。
|結(jié)論
· 與手動(dòng)操作相比,，使用AI智能生命數(shù)據(jù)庫M9時(shí),，取出凍存盒的工作流程步驟大大簡(jiǎn)化；
· 在凍存架取出后的前30秒,，AI智能生命數(shù)據(jù)庫M9的樣本升溫速率比手動(dòng)低70%,；
· 與手動(dòng)相比，使用M9存儲(chǔ)系統(tǒng)無關(guān)樣本的Tg升溫時(shí)間要長(zhǎng)51%,；
· 與手動(dòng)相比,，使用M9存儲(chǔ)系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)人員低溫“0”接觸，一鍵全自動(dòng)挑選樣本,，降低人為操作出錯(cuò)率及交叉污染,；
· 與手動(dòng)相比，使用M9存儲(chǔ)系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)一人一碼可溯源可追蹤,，支持整存零取/零存整取等操作場(chǎng)景,；
· 與手動(dòng)相比，使用M9存儲(chǔ)系統(tǒng)可與AMR機(jī)器人,、深低溫自動(dòng)化存儲(chǔ)系統(tǒng)無縫對(duì)接,，實(shí)現(xiàn)全庫區(qū)無人值守樣本庫管理；
· 如果手動(dòng)取出凍存架,，需要徹底了解升溫速率,、環(huán)境變量和影響因素。制定SOP并定期審核,，以確保高價(jià)值樣本始終安全保持在Tg以下,；
· 將任一凍存架放回LN2液氮罐后，樣本將繼續(xù)升溫,，不同的樣本體積將以不同的速率升溫,，即1mL凍存管的升溫速度比2mL凍存管快約60%。
參考文獻(xiàn)：
1 Warhurst, J., Fink, J., Holmes, T. et al. (2015 May).Protection of innocents: continued sample warm up after return to a cryogenic environment (below -150°C) following a transient ambient picking operation. Oral presentation presented at annual International
Society of Cellular Therapy conference, Las Vegas, NV.
2 Salvetti, M., Fink, J. Barlett, A. et al. (2015, May). Thermal excursions of cryogenically frozen vials (below -150°C) and the risk of rising above Tg,H2O: analyzing warm-up rates from cryogenic storage to both dry ice and ambient temperature environments.
Poster presented at annual International Society of Cellular Therapy conference, Las Vegas, NV.
