細(xì)胞凍存與復(fù)蘇是一種用于長期儲(chǔ)存細(xì)胞的技術(shù),。在這個(gè)過程中,，細(xì)胞被置于低溫環(huán)境中，減緩其代謝活動(dòng),。通過將細(xì)胞冷凍保存在液氮中（通常為-196℃）,，細(xì)胞暫時(shí)脫離生長狀態(tài),，但其細(xì)胞特性得以保存。當(dāng)需要時(shí),，可以通過復(fù)蘇將這些凍存的細(xì)胞重新激活，以供實(shí)驗(yàn)使用,。這種方法能夠適度地保存一定數(shù)量的細(xì)胞,，防止細(xì)胞受到污染或其他意外事件的影響，從而發(fā)揮了細(xì)胞保種的作用,。
本文將為大家介紹細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的技術(shù)要點(diǎn)和操作步驟,。
細(xì)胞凍存原理
當(dāng)細(xì)胞降溫至零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水,，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高,，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。
如果緩慢冷凍,，可使細(xì)胞逐步脫水,，以防止細(xì)胞內(nèi)形成大冰晶；相反,，結(jié)晶就大,，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜,、細(xì)胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融,，目的是防止小冰晶形成大冰晶,，即冰晶的重結(jié)晶。
低溫保護(hù)劑的應(yīng)用原理
1,、在細(xì)胞凍存時(shí)加入低溫保護(hù)劑,，增加細(xì)胞滲透壓穩(wěn)定性，減緩慢速降溫過程中的脫水皺縮現(xiàn)象,，能大大提高凍存效率,；
2、常用的低溫保護(hù)劑是DMSO（二甲基亞砜）,，它是一種滲透性保護(hù)劑,，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對(duì)水的通透性,，降低冰點(diǎn),，延緩凍結(jié)過程能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶,，減少胞內(nèi)冰晶,，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。
細(xì)胞凍存方法
方法一：使用程序凍存盒
步驟1：配制程序凍存液,，放在室溫備用或放在4℃預(yù)冷
步驟2：離心收集對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞（貼壁細(xì)胞消化下來離心,，懸浮細(xì)胞直接離心，轉(zhuǎn)速1200rpm或250g,，時(shí)間3min）
步驟3：用配制好的凍存液重懸細(xì)胞,，按照1~1.5mL/管分裝到凍存管中，擰緊管蓋,，做好標(biāo)記
步驟4：凍存管放入凍存盒,，凍存盒放入-80℃冰箱過夜（24h）
步驟5：凍存管從凍存盒取出，轉(zhuǎn)移至液氮長期保存
▲ 使用凍存盒操作示意圖
方法二：使用無血清非程序凍存液
步驟1：從冰箱拿出無血清非程序凍存液,，待用
步驟2：離心收集對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞（貼壁細(xì)胞消化下來離心,，懸浮細(xì)胞直接離心，轉(zhuǎn)速1200rpm或250g,，時(shí)間3min）
步驟3：棄上清,，加入適量無血清非程序凍存液，重懸細(xì)胞
步驟4：按照1~1.5mL/管的量分裝到凍存管中,，擰緊管蓋,，做好標(biāo)記
步驟5：將凍存管直接移入-80℃冰箱中，24h后轉(zhuǎn)移至液氮長期保存
▲ 使用無血清非程序凍存液操作示意圖
方法三：手動(dòng)梯度降溫
步驟1：配制程序凍存液,，放在室溫備用或放在4℃預(yù)冷
步驟2：離心收集對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞（貼壁細(xì)胞消化下來離心,，懸浮細(xì)胞直接離心,，轉(zhuǎn)速1200rpm或250g，時(shí)間3min）
步驟3：用配制好的凍存液重懸細(xì)胞,，按照1~1.5mL/管分裝到凍存管中,，擰緊管蓋，做好標(biāo)記
步驟4：凍存管按照【4℃（20min）→-20℃（30min）→-80℃（24h）→液氮】的順序放置
▲ 手動(dòng)梯度降溫操作示意圖
細(xì)胞復(fù)蘇原理
復(fù)蘇時(shí),，一般以很快的速度升溫,，1-2分鐘內(nèi)即恢復(fù)到常溫，細(xì)胞內(nèi)外不會(huì)重新形成較大的冰晶,，也不會(huì)暴露在高濃度的電解質(zhì)溶液中過長的時(shí)間,，從而無冰晶損傷和溶質(zhì)損傷產(chǎn)生，凍存的細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后仍保持其正常的結(jié)構(gòu)和功能,。冷凍保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞的冷凍保護(hù)效果還與冷凍速率,、冷凍溫度和復(fù)溫速率有關(guān)。
細(xì)胞一般采用快速融化以避免慢速融化水分滲入細(xì)胞內(nèi)再次形成胞內(nèi)結(jié)晶損傷細(xì)胞,。
細(xì)胞復(fù)蘇方法
步驟1： 取出凍存管,，從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃溫水中,，并不時(shí)搖動(dòng),，促使其盡快融化。
步驟2：處理細(xì)胞懸液,，從37℃水浴中取出凍存管,，打開蓋子，用吸管吸出細(xì)胞懸液,，將其加入離心管中,，并滴加10倍以上的培養(yǎng)液，然后混勻,。
步驟3：離心,，進(jìn)行1,000 rpm，5分鐘的離心,。
步驟4：調(diào)整細(xì)胞密度，棄去上清液,，加入含10%小牛血清的培養(yǎng)液以重懸細(xì)胞,。進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度后,，將其接種到培養(yǎng)瓶中,，并置于37℃培養(yǎng)箱中，靜置培養(yǎng),。
步驟5：繼續(xù)培養(yǎng),，次日更換一次培養(yǎng)液,，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。
細(xì)胞凍存,、復(fù)蘇注意事項(xiàng)
1. 確保細(xì)胞狀態(tài)良好：在凍存之前,，確保細(xì)胞具有良好的形態(tài)，并且沒有污染,。
2. 選擇適合的凍存液：根據(jù)細(xì)胞類型選擇合適的凍存液,，并按照相應(yīng)的操作規(guī)程進(jìn)行細(xì)胞的凍存。
3. 控制細(xì)胞密度：要控制好細(xì)胞的密度,，避免過低或過高影響凍存效果,。不同的凍存液針對(duì)不同細(xì)胞有適當(dāng)?shù)膬龃婷芏确秶源_保細(xì)胞在冷凍和復(fù)蘇過程中的存活率,。
4.盡快冷凍：細(xì)胞懸液加入凍存液后盡量短時(shí)間在常溫放置,，因?yàn)槌叵翫MSO對(duì)細(xì)胞會(huì)造成損傷。建議盡快通過程序降溫或一步法等方式進(jìn)行細(xì)胞的冷凍保存,。
5. 合理存放：細(xì)胞長期存放在-80℃冰箱時(shí),，建議靠冰箱內(nèi)側(cè)放置樣本，避免開關(guān)冰箱導(dǎo)致溫度不穩(wěn)定影響細(xì)胞保存效果,。
6. 檢測(cè)存活率：細(xì)胞凍存后應(yīng)取出一管進(jìn)行復(fù)蘇,，并檢測(cè)細(xì)胞的存活率。為穩(wěn)妥起見,，可在細(xì)胞凍存半年后進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng),，并觀察細(xì)胞生長情況后繼續(xù)凍存。
7. 溫和解凍：使用適當(dāng)?shù)姆椒ń鈨黾?xì)胞,，如將凍存管放入37°C的水浴中直至完全解凍,。避免使用高溫或暴露時(shí)間過長的方法，以減少DMSO對(duì)細(xì)胞的毒性作用,。
8. 勻速搖晃：細(xì)胞融解過程應(yīng)勻速,、均一地?fù)u晃以加速融解，同時(shí)避免流體剪切力對(duì)細(xì)胞的損傷,。
9.盡快去除DMSO：已融解的凍存細(xì)胞應(yīng)盡快在常溫下存放,，并盡快離心去除DMSO。
